Морфология прокариотов (бактерий)






НазваниеМорфология прокариотов (бактерий)
страница6/10
Дата публикации17.03.2015
Размер1.36 Mb.
ТипДокументы
d.120-bal.ru > Биология > Документы
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
Тема: Основы генетической инженерии и медицинской биотехнологии.

Учебная цель:

1. Изучить способы передачи генетической информации между бактериями:

трансдукция, трансформация и конъюгация.

2. Изучить основы биотехнологии и генетической инженерии.
Студент должен знать:

1. Формы изменчивости микроорганизмов.

2. Условия возникновения изменчивости микроорганизмов, их практическое значение.

3. Сущность биотехнологий, цели и задачи.

4. Микроорганизмы и процессы, применяемые в медицинской биотехнологии.

5. Применение генетической инженерии в биотехнологии.

6. Генетические рекомбинации микроорганизмов.
Студент должен уметь:

1.Учесть результаты опыта трансформации.

2. Учесть результаты опыта трансдукции.

3. Учесть результаты опыта коньюгации.
План занятия:

1. Медицинская биотехнология.

2. Генетические рекомбинации: трансдукция, конъюгация, трансформация

3. Роль генетических рекомбинаций в генетической инженерии и медицинской

биотехнологии.

4. Использование плазмид в генно-инженерных исследованиях.

5.Применение генетических и молекулярно-биологических методов в

диагностике инфекционных заболеваний: ПЦР, метод молекулярных зондов.

6.Биопрепараты, получаемые методом генной инженерии (вакцины,

моноклональные антитела, гормоны, диагностикумы).
Самостоятельная работа студентов

1.Учет результатов опыта трансформации.

2. Учет результатов опыта трансдукции.

3. Учет результатов опыта коньюгации.

4.Указать правильные ответы в тестовых заданиях.

5.Зарисовка таблиц.

ИНФОРМАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ
Постановка опыта трансформации

Реципиент — штамм Bacillus subtilis Str (сенная палочка, чувствительная к стрептомицину); донор — ДНК, выделенная из штамма В. Subtilis Str (устойчивого к стрептомицину). Селективная среда для отбора рекомби-нантов (трансформантов) питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина.

К 1 мл бульонной культуры В. Subtilis добавляют 1 мкг/мл раствора ДНКазы в 0,5 мл раствора хлорида магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма, и выдерживают в течение 5 мин. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов (трансформантов) 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры в изотоническом растворе хлорида натрия готовят 10-кратные разведения до 10-5-10-6 (для получения сосчитываемого количества колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина, а для контроля — на агар со стрептомицином. На последней среде реципиентная культура не должна расти, поскольку она чувствительна к стрептомицину. Посев инкубируют, при 370 С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма.

Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реципи-ентного штамма в разведении 10-5 выросло 170 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси — 68 колоний рекомбинантного штамма. Поскольку каждая колония образовалась в результате размножений только одной бактериальной клеткой, то в 0,1 мл засеянной культуры реципиента содержится 170 х 105 жизнеспособных клеток, а в 1 мл — 170 х 106, или 1,7 х 108. В то же время в 0,1 мл смеси находится 68 рекомбинантных клеток, а в 1 мл — 680, или 6,8 х 102.

Таким образом, частота трансформации в данном опыте будет равна:

Постановка опыта специфической трансдукции

Реципиент — штамм Е. coli lac-, лишенный 3-галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг — фаг X dgal, в геноме которого часть генов замещена (3-галактозидазным опе-роном Е. coli. Он является дефектным, т. е. не способен вызывать продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом кишечной палочки, и обозначается буквой d (фаг dgal) с названием содержащегося в геноме бактериального оперона gal. Селективная среда — среда Эндо, на которой лактозоотрицательные бактерии реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного штамма приобретают красный цвет с металлическим оттенком. К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага dgal в концентрации 106- 107 частиц в 1 мл. Смесь инкубируют в течение 60 мин при 370С, после чего готовят ряд 10-кратных разведений (в зависимости от предполагаемой концентрации бактерий) для получения сосчитываемого количества колоний. Из пробирки с разведением 10-6 делают высев по 0,1 мл культуры на 3 чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверхности среды.

Посевы инкубируют в течение 1 суток, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют частоту трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (транс-дуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штамма.

Например, после посева 0,1 мл смешанной культуры в разведении 10-6 на 3 чашках со средой Эндо выросло соответственно 138, 170 и 160 бесцветных колоний реципиентного штамма, на первой и последней чашках — 5 и 1 колонии трансдуктантов красного цвета. Следовательно, частота трансдукции в этом случае будет равна:

Постановка опыта конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы, который содержит ген leu, контролирующий синтез лейцина.

Донор — штамм Е. coli K12 Hfr leu StrS; реципиент — штамм Е. Coli K12 F- leu+ StrR . Hfr — обозначение состояния, для которого характерна высокая частота рекомбинации. Селективная среда для выделения рекомбинантов -минимальная глюкозосолевая среда: КН2РО4 — 6,5 г, MgSO4 — 0,1 г, (NH4)2SO4 — 1 г, Ca(NO3)2 — 0,001 г, FeSO4 — 0,0005 г, глюкозы — 2 г, стрептомицина — 200 ЕД/мл, дистиллированной воды — 1 л.

К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора. Посевы инкубируют при 370 С в течение 30 мин. Затем смесь разводят до 10-2-103 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же среду высевают донорский и реципиентный штаммы, которые не будут расти на ней, т. к. первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Кроме того, культуру донорского штамма высевают на селективную среду без стрептомицина, а культуру реципиентного штамма — на полную среду (питательный агар) с антибиотиками для определения числа жизнеспособных клеток. Посевы инкубируют при 370 С до следующего дня. После подсчета числа выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным.

Например, после посева 0,1 мл смеси донорских и реципиентных культур в разведении 10-2 выросло 150 колоний рекомбинантов, а после посева 0,1 мл культуры реципиента из разведения 10-6 75 колоний. Таким образом, частота рекомбинации будет равна:


Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — один из современных молекулярно-генетических методов, основанный на принципе многократного копирования (амплификации) определенного участка ДНК или РНК. В результате этого процесса количество определяемой ДНК в пробе возрастает в десятки миллионов раз, что делает возможной последующую детекцию амплифицированной ДНК. Таким образом, ПЦР позволяет выявить ничтожно малые фрагменты ДНК, характерные для определенного вида микробов, и точно идентифицировать этот вид.

ПЦР в клетке была открыта более 30 лет назад Нобелевскими лауреатами А.Кронбергом и Д.Ледебергом. Принцип метода ПЦР in vitro был разработан К.Мюлисом в 1983 году, также ставшим Нобелевским лауреатом. Почти немедленно появились сообщения о его практическом применении. Однако в этот период из-за отсутствия необходимого оборудования ПЦР проводили путем ручного переноса пробирок в термостаты с нужной температурой. Необходимый для синтеза ДНК фермент ДНК-полимераза разрушался после каждого этапа денатурации (при 95°С), поэтому требовалось постоянное добавление его новых порций.

В 1988 г была получена термостабильная ДНК-полимераза из бактерии Thermophilus aquaticus, живущей в горячих источниках. Были разработаны специальные приборы для амплификации (термоциклеры). Созданы современные лазерные технологии сиквенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК). Это привело к тому, что ПЦР стал доступным для широкого применения в лабораторной практике.

В настоящее время наиболее быстро развиваются пять основных направлений генной диагностики:

- инфекционных заболеваний (туберкулез, гонорея, вирусные инфекции — гепатиты В и С, ВИЧ, ЦМВ и др.),

  • онкологических заболеваний,

  • генетических заболеваний,

- идентификация личности (трансплантация органов и тканей, судебная медицина, определение отцовства),

- диагностика патогенов в пище.

Исследуемый материал: кровь, сыворотка, лаважные массы, мокрота, слюна, желудочный сок, биопсийный материал, мазки, смывы.
Постановка ПЦР включает следующие этапы:

1. Выделение ДНК (РНК) из исследуемого материала (пробоподготовка).

Клетки лизируют детергентами или высокой температурой. Затем отделяют ДНК от клеточных обломков и разрушают клеточные нуклеазы. Все это обеспечивают приборы: миницентрифуги, развивающие скорость 12000 -14000 оборотов в минуту, вортексы для перемешивания, минитермостаты для пробирок, обеспечивающие быстрое изменение температуры от +30°С до +100°С.

2. Непосредственная амплификация выделенных участков (копий) нуклеиновых кислот.

ПЦР обеспечивает быстрое и многократное умножение, амплификацию (amplification — усиление, увеличение) количества фрагментов генома. Для этого в пробирку с выделенной ДНК добавляют необходимые реактивы и помещают в амплификатор (термоциклер). Этот прибор позволяет циклически изменять и поддерживать перепады температур в пробирке на несколько десятков градусов за несколько секунд. Если в пробирке есть искомая ДНК, то в ней происходит ряд процессов:

  • В результате нагревания до 94 -95°С двойная цепь ДНК разделяется на две отдельные цепи.

  • К одноцепочечной ДНК-мишени присоединяется праймер.

Праймер — это последовательность из 15 — 30 нук-леотидов, комплементарная маркерному фрагменту ДНК. При создании оптимальной температуры (45-70°С) происходит связывание (отжиг) праймера с соответствующим участком ДНК: один праймер — на одной нити, другой — на второй нити ДНК. Отжиг протекает в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа, означающим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина — цитозин.

- Синтез (элонгация) — достраивание второй цепи

ДНК.

ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды к праймерам, достраивая двухцепочечные фрагменты ДНК (~ при 72°С). Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых цепей в следующем цикле амплификации — это и есть цепная реакция в ПЦР. В результате количество копий фрагмента увеличивается в геометрической прогрессии и через 25 циклов амплификации синтезируется 106 копий фрагмента. Через 30 — 40 циклов синтезируется такое количество ДНК, которое можно визуально учитывать после электрофореза в агарозном геле или другими способами.


3. Определение (детекция) продуктов ПЦР, полученных на втором этапе.

Детекция | I положительные

Выявление наработанного продукта чаще всего проводят при помощи электрофореза в 2-3% агарозном геле, содержащем бромид этидия (специфический флюоресцентный краситель ДНК). Поглощая ультрафиолетовый свет краситель, связанный с ДНК, флюоресцирует. В результате видна оранжевая полоска на уровне контрольной ДНК. Кроме того, используют ферментно-гибридизационный метод или ПЦР в режиме «реального времени» с помощью флюоресцентных красителей.

Под генной (генетической) инженерией подразумевают целый комплекс технологий, методов, процессов, посредством которых получают рекомбинантные (созданные благодаря биотехнологии на основе ДНК) РНК и ДНК, а также гены из клеток организмов, осуществляют различные манипуляции с генами и вводят их в другие организмы. Генная инженерия не является наукой – это только набор инструментов, использующий современные достижения клеточной и молекулярной биологии, генетики, микробиологии и вирусологии

Учёные, биохимики и молекулярные биологи научились модифицировать гены или создавать совершенно новые, комбинируя гены различных организмов. Они научились также синтезировать гены, причём точно по заданным схемам. Они научились вводить такие искусственные гены в живые организмы и заставили их там работать. Это было начало генетической инженерии. Задумаемся над следующим обстоятельством.

Основа микробиологической, биосинтетической промышленности — бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых — способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение — аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту.

Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Иногда нужны организмы, способные развиваться при повышенных температурах или в присутствии веществ, безусловно смертельных для других видов микроорганизмов. Задача получения таких промышленных штаммов очень важна, для их видоизменения и отбора разработаны многочисленные приёмы активного воздействия на клетку — от обработки сильно действующими ядами до радиоактивного облучения.

Медицинская биотехнология - обьединение области биотехнологии, медицинских приложений, в частности в области здравоохранения.

Большинство фармацевтических препаратов относительно так называемых simple molecules найдены путем проб и ошибок для лечения симптомов болезни или заболевания. Биофармацевтика large biological molecules, белков, - это относительно молодая отрасль. Ее продукция взаимодействует с недоступными традиционным лекарствам проблемами организма. Пациент обычно принимает small molecule в качестве таблетки, в то время как large molecule вводят.

Малые молекулы производят химическим путем, большие же выращивают из живых клеток подобных тем, что находятся в организме человека: например, клеток бактерий, дрожжевых, животных или растительных.

Фармакогеномика - это изучение того, как индивидуальное генетическое наследие организма реагирует на различные лекарства. То есть изучение взаимосвязи между фармацевтическими препаратами и генетикой. Задача фармакогеномики в разработке и производстве лекарственных препаратов, генетически подходящих любому человеку. Фармакогеномика ведет разработки по следующим направлениям:

1.Развитие индивидуальных лекарств. Благодаря фармокогеномике фармацевтические компании могут создавать препараты на основе белков, ферментов и РНК молекул, связанных с конкретными генами и заболеваниями.

  2.Более точные методы определения необходимой дозы препарата. Знание генетики пациента позволит врачам определить насколько хорошо его тело может переносить медицинское воздействие. Это позволит максимально увеличить стоимость медикаментов и уменьшить возможность передозировки.

3.Совершенствование лекарств. Находить возможные методы лечения проще, зная генетическую структуру цели. Гены связаны с возникновением многочисленных заболеваний и расстройств, с современной биотехнологией они могут быть использованы в качестве мишеней для разработки новых эффективных методов лечения, которые значительно сократили бы процесс открытия новых лекарств.

4.Повышение качества вакцин. Безопасные вакцины могут быть изготовлены организмом, измененном при помощи генной инженерии. Эти вакцины будут вызывать иммунный ответ без соответствующего инфекционного риска. Такие вакцины будут недорогими, стабильными, легко хранящимися, и могут быть настроены на несколько патогенов одновременно.

  Генетическое тестирование включает в себя непосредственно изучение ДНК молекулы. И для определения мутировавшей последовательности ученые сканируют ДНК пациента.

Существует два типа генетического тестирования. В первом, исследователь может определять короткие отрезки ДНК, чьи последовательности дополняют мутировавшие. Во втором, проводить путем генной терапии сравнение последовательности ДНК в геноме пациента со здоровым образцом.

Генетическое тестирование в настоящее время может обнаружить мутации, связанные с редкими генетическими нарушениями, такими как кистозный фиброз или серповидно-клеточная анемия. Однако генетические тесты не могут обнаруживать каждую мутацию, связанную с определенным условием, поскольку многие из них еще не открыты.

Тестовый контроль:
1. Что такое трансформация?

а) восстановление поврежденной ДНК;

б) передача генетической информации при контакте бактериальных клеток

разной «половой» направленности;

в) передача генетической информации с помощью фрагмента ДНК;

г) передача генетической информации от клетки донора клетке реципиента с

помощью бактериофага.
2.Для конъюгации характерно:

а) передача генетического материала при помощи бактериофага;

б) необходим контакт клеток донора и реципиента;

в) передача генетического материала с помощью РНК;

г) передача генетического материала с помощью полового фактора.
3.Для трансдукции характерно:

а) передача генетического материала при помощи бактериофага;

б) необходим контакт клеток донора и реципиента;

в) передача генетического материала с помощью РНК;

г) передача генетического материала с помощью полового фактора.
4. У каких микроорганизмов материальной основой наследственности является РНК?

а) у бактерий;

б) у спирохет;

в) у РНК-содержащих вирусов;

г) у ДНК-содержащих вирусов;

д) у микоплазм.
5. Что относят к внехромосомным генетическим структурам?

а) рибосомы;

б) полисомы;

в) плазмиды;

г) мезосомы;

д) ранспозоны.

Лабораторная работа №13
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

Похожие:

Морфология прокариотов (бактерий) iconМорфология бактерий
Нобелевской премией за разработку клонально-селекционной теории антителогенеза награжден

Морфология прокариотов (бактерий) iconПрограмма практических занятий по общей микробиологии для студентов...
...

Морфология прокариотов (бактерий) iconЛекций по микробиологии для фармацевтического факультета
Вводная лекция. Предмет и содержание микробиологии, основные этапы развития науки. Значение для деятельности провизоров. Морфология...

Морфология прокариотов (бактерий) iconМетодические рекомендации для студентов к практическим занятиям по...
Тема: «Морфология обратимого и необратимого повреждения клеток и тканей: морфология нарушений углеводного и пигментного обмена. Морфология...

Морфология прокариотов (бактерий) iconМетодические рекомендации для студентов к практическим занятиям по...
Тема: «Морфология обратимого и необратимого повреждения клеток и тканей: морфология нарушений углеводного и пигментного обмена. Морфология...

Морфология прокариотов (бактерий) iconСанитарно-эпидемологическое значение иксодовых клещей как переносчиков...
Морфология иксодовых клещей. На территории СНГ зарегистрировано более 49 видов иксодовых клещей. Все они –временные эктопаразиты...

Морфология прокариотов (бактерий) iconКалендарно-тематический план лабораторно-практических занятий (3...
Патологическая анатомия: содержание, задачи, объекты и методы исследования. Морфология обратимого и необратимого повреждения клеток...

Морфология прокариотов (бактерий) iconКак происходит заражение?
Создаются условия для активизации других видов бактерий, а также для проникновения извне новых бактерий, вызывающих вторичную инфекцию...

Морфология прокариотов (бактерий) iconПрезентация «Роль бактерий в природе и жизни человека»
Цель: сформировать у учащихся знания о значении бактерий в природе и жизни человека

Морфология прокариотов (бактерий) iconЗанятие 3 смешанные дистрофии: морфология нарушений обмена пигментов...
Смешанные дистрофии: морфология нарушений обмена пигментов (гемоглобиногенных, протеиногенных, липидогенных)

Вы можете разместить ссылку на наш сайт:


медицина


При копировании материала укажите ссылку © 2016
контакты
d.120-bal.ru
..На главную