Методические разработки к практическим занятиям по иммунологии для студентов лечебного и педиатрического факультетов Махачкала 2013

Министерство образования и науки РФ ГБОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская академия» МЗ РФ Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии Методические разработки к практическим занятиям по иммунологии для студентов лечебного и педиатрического факультетов Махачкала 2013 Составители: Саидов М.С. – зав.кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии, к.м.н., доцент; д.б.н., проф. Омарова С.М., к.м.н., доценты - Царуева Т.В.,Гаджиева А.Д., к.м.н., ассистенты Алиева А.И., Саидова Б.М., Исаева Р.И. Рецензент: зав. кафедрой патологической физиологии д.м.н., профессор Саидов М.З. Пособие рекомендовано ЦК МС ДГМА для использования в учебном процессе (протокол №_____ от «___»_________________2013г.) Занятие № 1 Тема: Иммунитет. Виды иммунитета. Врожденный иммунитет. Клеточные факторы. Фагоцитоз. Цель занятия: Изучить виды иммунитета, механизмы и факторы неспецифической резистентности. Вопросы обсуждения: Современное понятие иммунитета. Виды иммунитета. Врожденный иммунитет(неспецифическая резистентность). Факторы. Клеточные факторы врожденногоиммунитетаНР. Фагоцитоз. Стадии фагоцитоза. Незавершенный фагоцитоз. Фагоцитарная активность, фагоцитарное число их определение. Естественные киллеры, их функция в организме. Самостоятельная работа студентов: Составить таблицу – «Виды иммунитета» Определение фагоцитарной активности в готовых препаратах (подсчет фагоцитарного числа и фагоцитарного показателя) Изучить незавершенный фагоцитоз по готовым препаратам. Методические указания к самостоятельной работе: Определение фагоцитарного числа и фагоцитарного показателя invitro Техника постановки: в небольшую пробирку наливают последовательно микропипеткой 0,05мл 2% р-ра цитрата натрия, 0,1мл испытуемой крови и 0,05мл 2-миллиардной взвеси S. Aureus (штамм 209). Тщательно перемешивают и выдерживают 30мин. При 37ºС. После этого содержимое пробирки вновь перемешивают и готовят из него тонкие мазки, которые фиксируют метанолом или смесью Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимзе в течении 20 – 30 минут. Препараты микроскопируют, передвигая мазок в одном направлении, подсчитывают число фагоцитированных бактерий в 50 лейкоцитах. Исходя из этого определяют среднее количество фагоцитированных бактерий на один лейкоцит. Изучение незавершенного фагоцитоза в препаратах из отделяемого уретры больного гонореей. Результаты записать в тетрадь. Мазки фиксируют на пламени горелки и окрашивают по Грамму (или метиленовой синькой). При микроскопии мазков отмечают наличие грамотрицательных диплококков, расположенных внутри фагоцитов (лейкоцитов). Зарисовать в тетради. Расчет показателей фагоцитоза Процент фагоцитирующих нейтрофилов (% фагоцитоза) – считают процент клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего количества посчитанных нейтрофилов. В норме процент фагоцитоза у взрослых -60-90%, у детей – 30-65%. Фагоцитарное число – это среднее количество поглощенных бактерий или частиц на 1 клетку (полиморфно – ядерный лейкоцит). В норме фагоцитарное число после 30 мин инкубации составляет 4,5- 7,5. Показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - оценивают переваривающую функцию нейтрофилов. Это отношение количества переваренных микробов к общему числу поглощенных микробов (переваренных и непереваренных), выраженное в процентах. Норма для взрослых - 64 – 72%. Индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ). В норме через 30 мин начинается переваривание поглощенных микроорганизмов нейтрофилами, через 2 ч. оно должно закончиться. Поэтому процент фагоцитирующих нейтрофилов и среднее число поглощенных микроорганизмов после 2-часовой экспозиции меньше, чем после 30 – минутной, а ИЗФ - больше 1,0, что указывает на завершенность фагоцитоза. ИЗФ меньше 1, 0 свидетельствует о сниженной киллерной функции нейтрофилов. ИЗФ – среднее число поглощенных микроорганизмов через 30 мин/ среднее число поглощенных микроорганизмов через 120 мин. Занятие № 2. Тема: Врожденный иммунитет. Клеточные и гуморальные факторы неспецифической резистентности организма. Цель занятия: Изучить клеточные и гуморальные факторы неспецифической резистентности организма. Вопросы обсуждения: Врожденный иммунитет. Внешние и внутренние барьеры неспецифической резистентности организма. Клеточные и гуморальные факторы врожденного иммунитета. Что такое лизоцим? Методика определения лизоцима в слюне Комплемент, пути активации комплемента. Интерферон, острофазные белки сыворотки крови. Воспаление, признаки воспаления. Самостоятельная работа студентов: Определить титр лизоцима в слюне по демонстрационному материалу Разобрать схему классического и альтернативного путей активации комплемента. (табл.) Поставить опыт по определению бактерицидного действия кожи Изучить комплементарную активность сыворотки крови по демонстрационному материалу. Методические указания к самостоятельной работе Определение титра лизоцима в слюне Лизоцим представляет собой термостабильный белок типа муколитического фермента. Он содержится в тканевых жидкостях животных и человека –в слезах, слюне, перитонеальной жидкости, плазме, сыворотке крови, лейкоцитах, материнском молоке и др. Лизоцим продуцируется моноцитами крови и тканевыми макрофагами. Он вызывает лизис бактерий, но не активен в отношении вирусов. Для определения титра готовят ряд последовательных разведений слюны в пробирках, в каждую из которых вносят по 1 мл. суспензии суточной культуры Micrococcuslisodecticus, содержащей 1 млрд/мл микробных тел. (табл) Протокол определения действия лизоцима слюны на Micrococcuslisodecticus Титр Ингредиенты 1:2 1:4 1:8 1:16 Кс Кф Кк 1 2 3 4 5 6 7 Слюна 1,0 1,0 _ _ Физ. раствор 1,0 1,0 1,0 1,0 _ 1,0 _ Взвесь суточной культуры Mlisodecticus 1,0 1,0 1,0 1,0 _ _ 1,0 Примечание: Из 4- пробирки 1,0 мл вылить в банку с дезраствором. После инкубации в термостате в течение 3 ч определяют титр лизоцима по последнему разведению, в котором наблюдается полный лизис бактерий – просветление. Более точную оценку активности лизоцима можнопроводить, измеряя спектрофотометрическим методом изменение оптической плотности микробной взвеси после инкубации ее с разведениями лизоцима. Пользуясь калибровочными кривыми или специальными таблицами, активность лизоцима можно выразить в мкг/мл. Уровень содержания лизоцима в слюне здоровых людей колеблется от 50 до 70 мкг/мл. Определение бактерицидного действия кожи Важным фактором неспецифической резистентности является функция кожи как механического барьера для внедрения паразита. Отторжение верхних слоев эпидермиса, секреты сальных и потовых желез способствуют их удалению с поверхности кожи. Существенную роль в элиминации микробов с поверхности кожи играют различные микробоцидные субстанции (молочные и жирные кислоты и др.), обеспечивающие ее «самоочищение». Поэтому различные микроорганизмы, не являющиеся ее постоянными обитателями, не могут в течение продолжительного времени сохраняться на коже. Бактерицидность кожных секретов зависит от их кислотности. Для определения бактерицидной активности кожи суточную бульонную культуру кишечной палочки (1:50000) наносят на внутреннюю поверхность предплечья и распределяют равномерно шпателем. Делают отпечаток на предметное стекло со средой Эндо с одного участка исследуемой кожи, а через 15 минут - со смежного. Инкубируют посевы 18-24 часа при 37°С и подсчитывают колонии на 3 см2 поверхности каждой пластины. Индекс бактерицидности (ИБ) вычисляют по формуле: ИБ=К1-К2х100 К1 где K l - количество колоний сразу после нанесения на кожу, К 2 - количество колоний через 15 минут после контакта. У здоровых людей ИБ равен 90-100% Бактерицидная активность сыворотки крови (БАСК) Бактерицидная активность сыворотки крови (БАСК) является показателем естественной способности крови к самоочищению. В 1886 г. Высокович обнаружил, что различные бактерии, введенные в кровь кроликов и собак, не удаляются из организма выделительными органами, если эти микробы не повреждены. Исчезновение их из организма связано с наличием в сыворотке особых веществ, убивающих и растворяющих микробные клетки. Бактерицидное действие сыворотки крови распространяется как на грамположительные, так и на грамотрицательные бактерии. Методика: Из 18-ти часовой культуры кишечной палочки методом серийных разведений готовят рабочую концентрацию до 40-50 тыс. м. т. в 1 мл. Рабочую взвесь тест-микробов в количестве 0,1 мл высевают на чашку Петри с МПА. Шаблоном диаметром 20 мм по поверхности агара с культурой микроорганизмов делают отверстия (в центре и по периферии отмечают контрольные отверстия, на которые не наносится испытуемая сыворотка). На каждую площадку с посевом тест-культуры наносят пипеткой 0,05 мл исследуемой сыворотки. Через 24 часа инкубации в условиях термостата проводят подсчет выросших колоний, как на опытных, так и на контрольных площадках. Бактерицидную активность сыворотки крови рассчитывают по формуле: БАСК(%) =100х(1- конечное количество жизнеспособных бактерий) исходное количество бактерий Нормативное значение - 80 - 90% Занятие № 3 Тема:Иммунная система. Иммунокомпетентные клетки. Происхождение Т и В лимфоцитов, их функциональное значение в иммунных реакциях. Цель занятия: Изучить свойства иммунокомпетентных клеток и их взаимосвязь в иммунном ответе. Познакомиться с тестами определения Т и В лимфоцитов. Вопросы обсуждения: Центральные и периферические органы иммунитета. Принцип организации иммунной системы. Генез (развитие и дифференцировка) лимфоцитов и их значение в формировании клеточного и гуморального иммунитета. Понятие о предшественниках Т- и В- лимфоцитов. Сходство и различие Т- и В- лимфоцитов. Рециркуляция лимфоцитов. Понятие об иммунном ответе, его формы. Самостоятельная работа студентов: 1. Изучение препаратов со спонтанным розеткообразованием - определение количества Т-лимфоцитов (определить % Е - РОК) 2. Изучение бласттрансформации лимфоцитов под влиянием ФГА для определения функциональной активности Т-лимфоцитов (определить % бластов). 3. Микроскопия и зарисовка демонстрационных препаратов. 4. Оформление и защита протокола. Методические указания к самостоятельной работе Иммунологические методы диагностики - методы исследования иммунного статуса организма; применяются в педиатрии, акушерстве и гинекологии. Ныне принят двухэтапный метод оценки функционирования иммунной системы. На 1-м этапе выявляются обобщённые характеристики В- и T-систем иммунитета и фагоцитоза. К иммунологическим тестам 1-го уровня относят определение: 1) абсолютного и относительного числа лимфоцитов в периферической крови; 2) абсолютного и относительного числа Т- и В-лимфоцитов в крови; 3) концентрации сывороточных иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA); 4) фагоцитарной активности нейтрофилов. Сведения об абсолютном и относительном числе лимфоцитов являются интегральным показателем функционирования иммунной системы. Для определения Т-лимфоцитов используют реакцию спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-розеткообразование), В-лимфоцитов - реакцию розеткообразования с эритроцитами барана, несущими на своей поверхности комплекс антитело-комплемент (ЕАС-розеткообразование). Возможно также определение В-лимфоцитов методом спонтанногорозеткообразования с эритроциами мыши. К-во IgM, IgG, IgA чаще всего оценивается методом радиальноиимму-нодиффузии по Манчини. При различных заболеваниях наблюдаются стереотипные колебания уровня Т- и В-лимфоцитов, иммуноглобулинов, которые во многом сходны и лишены специфичности, т. к. связаны не с непосредственным этиологическим фактором, а со стрессовой реакцией организма на болезнь. Динамика уровней иммуноглобулинов, Т- и В-клеток очень важна для выявления больных с иммунологической недостаточностью, определения влияния на иммунную систему тех или иных лекарственных средств. О функциональной активности Т- и В-лимфоцитов судят по реакции бластной трансформации (РБТЛ) с использованием митогена - фитогемагглютинина (ФГА). Реакция бласттрансформации характеризует способность лейкоцитов к трансформации и размножению под воздействием антигенов, аллергенов и митогенов. Пролиферативный ответ лимфоцитов на антигены даёт представление о выраженности специфической сенсибилизации организма. Реакция бласттрансформации применяется для комплексной оценки иммунного статуса больного. Метод определения реакции бласттрансформации Микроскопия. Нормальные пределы реакции бласттрансформации Для РБТЛ с ФГА: 50-70% Для РБТЛ с антигеном: отрицательный Материал для анализа реакции бласттрансформации Плазма крови. Забор крови осуществляется в пробирку с гепарином. Кровь должна быть доставлена в лабораторию в течение 2 часов. Подготовка пациента к реакции бласттрансформации Забор крови осуществляют в утренние часы натощак. Накануне исследования и в день забора крови исключить жирную пищу. Факторы, влияющие на реакцию бласттрансформации Снижают: цитостатики, иммунодепрессанты, кортикостероиды, облучение ионизирующей радиацией. Расшифровка анализов РБТЛ с ФГА Повышение: гиперактивность иммунной системы при аллергических и аутоаллергических заболеваниях, активация антитрансплантационного иммунитета, острый период первичной инфекции, иммунный ответ на тимусзависимые антигены. Снижение: онкологические заболевания, вторичные иммунодефициты, первичные иммунодефициты, СПИД, тяжёлые вирусные инфекции, тяжёлые ожоги, травмы. РБТЛ с антигеном: Наличие пролиферативного ответа лимфоцитов на определенный антиген даёт представление о наличии и выраженности специфической сенсибилизации организма. Занятие № 4

Похожие:

	Методические разработки к практическим занятиям по кожным и венерическим... Методические разработки к практическим занятиям по кожным и венерическим болезням для студентов лечебного факультета		Методические разработки к практическим занятиям по дерматовенерологии,... ...
	Методические разработки к практическим занятиям (лабораторным занятиям,... Методические разработки рекомендованы к утверждению на заседании кафедры госпитальной хирургии, ортопедии и травматологии «28» августа...		Методические рекомендации к практическим занятиям по пропедевтике... Методические рекомендации к практическим занятиям по пропедевтике внутренних болезней для студентов 3 курса педиатрического факультета:...
	Учебно-методическое пособие для студентов лечебного, педиатрического,... Учебно-методическое пособие предназначено для студентов лечебного, педиатрического, медико-профилактического факультетов и может...		Учебно-методическое пособие для студентов лечебного, педиатрического,... Учебно-методическое пособие предназначено для студентов лечебного, педиатрического, медико-профилактического факультетов и может...
	Методические рекомендации к практическим занятиям по хирургическим... Ознакомление студентов с техникой эндоскопических и инструментальных методов диагностики, определением плана лечения и прогноза,...		Методические разработки к практическим занятиям по дерматовенерологии... Строение, функции кожи и слизистой полости рта. Основы диагностики болезней кожи: I и II морфологические элементы
	Учебно-методическое пособие Волгоград, 2004 Лучевые методы диагностики... Уч метод пособие для студентов лечебного, педиатрического факультетов./Сост к м н. Е. Д. Лютая – Волгоград 2004		Методические указания для студентов по дисциплине «патологическая анатомия» Методические указания предназначены для студентов III курса врачебных факультетов сгму лечебного, врача общей практики, стоматологического,...