Учебно-методическое пособие Мероприятие 2
Скачать 0.64 Mb.
|
| Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского Национальный исследовательский университет Учебно-научный и инновационный комплекс "Физические основы информационно-телекоммуникационных систем" Основная образовательная программа 020400.62 «Биология», общий профиль, квалификация (степень) бакалавр Учебно-методический комплекс по дисциплине «Ботаника» Широков А.И., Крюков Л.А. ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ РАСТЕНИЙ Электронное учебно-методическое пособие Мероприятие 1.2. Совершенствование образовательных технологий, укрепление материально-технической базы учебного процесса Нижний Новгород 2012 ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ РАСТЕНИЙ. Широков А.И., Крюков Л.А. Электронное учебно-методическое пособие. – Нижний Новгород: Нижегородский госуниверситет, 2012. – 49 с. Методическая разработка посвящена вопросам биотехнологии размножения растений (включая культуры клеток, тканей, органов и клонов растений). Современные биотехнологии предлагают принципиально новые пути для формирования нового и ценного для жизнедеятельности человека генетического разнообразия растений посредством отбора форм и клонов особей с искомыми признаками. Методическая разработка включает в себя краткие теоретические очерки по основным направлениям современной биотехнологии (включая культуры клеток, тканей, органов и клонов растений), а так же подробные планы практических занятий. В конце каждой темы приводятся вопросы для самоконтроля. Также приведен список рекомендуемой литературы и терминологический словарь. Электронное учебно-методическое пособие предназначено для студентов ННГУ, обучающихся по направлению подготовки 020400.62 «Биология», изучающих курс «Основы биотехнологии растений». Цели освоения дисциплины Целью практического курса «Основы биотехнологии растений» является обучение студентов методам микроклонального размножения растений на стерильных питательных средах. Задачами курса являются:
Место дисциплины в структуре ООП В рамках специального курса «Основы биотехнологии растений» студентов 4 курса обучающихся по специальности «ботаника» биологического факультета предполагается 18 часов лекций, 18 часов практических занятий и 36 часов самостоятельной работы. Общая трудоемкость дисциплины составляет 72 часа. Для полноценного освоения студентами курса необходимы базовые знания по анатомии растений, морфологии растений, физиология растений, биохимия растений, общая химия, основы микробиологии. Настоящее пособие так же может быть использовано студентами, аспирантами, преподавателями и специалистами биологических направлений в качестве практического руководства для проведения учебно-исследовательских и научно-исследовательских работ связанных с биотехнологиями растений. Компетенции обучающегося, формируемые в результате освоения практического курса В результате освоения дисциплины обучающийся должен знать организацию биотехнологической лаборатории, принципы и методы микроклонального размножения растений; уметь готовить стерильные питательные среды, иметь представления о культивировании растительного материала «in vitro»; владеть навыками работы на оборудовании стерильной биотехнологической лаборатории. Для реализации данной дисциплины в полном объеме планируется использовать следующее оборудование и материально-техническое обеспечение, закупленное по программе НИУ: Ламинарный бокс, сушильный шкаф, настольные стерилизаторы, дистиллятор, аналитические весы, бинокулярные микроскопы с цифровыми камерами, pH-метр, орбитальные шейкеры, магнитные мешалки, холодильные установки, микротом замораживающий, ультрафиолетовые облучатели, кондиционеры для регуляции температуры, дозаторы фиксированного и переменного объема, спиртовые горелки, пробирки биологические и химические, штативы для пробирок, чашки Петри, колбы конические (на 250 мл, 500 мл, 1000мл), пинцеты хирургические длинные, пинцеты стоматологические. ОГЛАВЛЕНИЕ Введение 1. Современная биотехнология растений, как наука и отрасль производства 1.1. Биотехнология производства культуры клеток, тканей и органов растений. 1.2. Биотехнология микроклонального размножения особей. 1.3. Генная инженерия. 1.4. Банк in vitro и криоконсервация; их значение для сохранения генофонда растений 2. Организация биотехнологической лаборатории.
Лабораторная работа № 1 3. Разнообразие и приготовление питательных сред. 3.1. Типы питательных сред и обзор их составов. 3.2. Гормональная регуляция в культуре клеток и тканей «in vitro» Лабораторная работа № 2 4. Типы эксплантов: Способы получения и методы стерилизации 4.1. Выделение апикальных меристем. 4.2. Выделение клеток, их групп и тканей. 4.3. Получение микрочеренков. 4.4. Стерилизация эксплантов и введение в «in vitro» Лабораторная работа № 3 Лабораторная работа № 4 Лабораторная работа № 5 5. Культивирование растительного материала in vitro 5.1. Основные принципы культивирования 5.2. Каллусогенез в культуре растительных клеток и тканей 5.3. Суспензионные культуры 5.4. Микрочеренкование. Лабораторная работа № 6 Лабораторная работа № 7 Рекомендуемая литература Приложение 1. Программа лекционного курса «Основы биотехнологии растений» Приложение 2. Терминологический словарь Современная биотехнология растений, как наука и отрасль производства Биотехнология - дисциплина, изучающая возможности использования живых организмов, их систем или продуктов их жизнедеятельности для решения технологических задач, а также возможности создания живых организмов с необходимыми свойствами методом генной инженерии. Современная биотехнология – это наука и отрасль производства, развивающаяся в трех основных направлениях: - молекулярная биология и генетическая инженерия; - микробиология и микробиологическая промышленность; - культура клеток и тканей in vitro. Применительно к растительным объектам биотехнология традиционно рассматривается в рамках следующих направлений: 1.Биотехнология производства культуры клеток, тканей и органов растений; 2. Биотехнология микроклонального размножения особей; 3. Генная инженерия; 4. Банк in vitro и криоконсервация; их значение для сохранения генофонда растений.
клеток, тканей и органов растений Клеточные технологии, основанные на культивировании in vitro органов, тканей, клеток и изолированных протопластов высших растений, могут облегчить и ускорить традиционный процесс создания новых сортов и видов. Они предлагают принципиально новые пути, такие как сомаклональная изменчивость, мутагенез на клеточном уровне, клеточная селекция, соматическая гибридизация для создания генетического разнообразия и отбора форм с искомыми признаками. Кроме того, клеточные технологии эффективны в создании безвирусного материала вегетативно размножаемых растений. Пионером клонального микроразмножения считается французский ученый Жан Морель, который в 50-х годах прошлого столетия получил первые растения – регенеранты орхидей. В это время техника культивирования апикальных меристем in vitro была уже хорошо разработана. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы и т.д. В нашей стране работы по микроклональному размножению были начаты в 30-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза ИФР РАН. Под руководством Р.Г. Бутенко были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы и др. растений и предложены промышленные технологии. В дальнейшем исследования по микроклональному размножении охватили и древесные растения. Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов ХХ-го столетия и связаны с именем Готре, который показал, что камбиальные ткани некоторых растений способны к каллусогенезу in vitro. Но первые растения - регенеранты осины, доведенные до почвенной культуры, были получены лишь в середине 60-х годов Матесом. Культивирование тканей хвойных пород in vitro долгое время редко использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования тканей, изолированных из растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные растения характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и т.д.), которые в изолированных тканях активируются. Окисленные фенолы обычно ингибируют деление и рост клеток, что ведет к гибели первичного экспланта или уменьшению способности тканей древесных растений к регенерации адвентивных почек, которая с возрастом растения-донора исчезает практически полностью. В настоящее время, несмотря на перечисленные трудности, насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, сосна, ель, секвойя и др.).
Термином "микроклонального размножения" называют массовое бесполое размножение растении in vitro, при котором полученные особи растений генетически идентичны исходному экземпляру. Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - микроклональное размножение. Микроклональное размножение - получение in vitro, неполовым путем, генетически идентичных исходному экземпляру растений. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность. В соответствии с научной терминологией клонирование подразумевает получение идентичных организмов из единичных клеток. Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения: - получение генетически однородного посадочного материала; - освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры; - высокий коэффициент размножения; - сокращение продолжительности селекционного процесса; - ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития; - размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами; - возможность проведения работ в течение всего года, а не только в течение вегетационного периода; - возможность автоматизации процесса выращивания. Существует несколько моделей микроклонального размножения, каждая из них имеет свои преимущества и недостатки: а) индукция развития адвентивных побегов непосредственно из ткани экспланта, метод является очень эффективным, все признаки размножаемого образца полностью сохраняются; б) развитие пазушных побегов основано на снятии апикального доминирования, это наиболее надежный способ, заключающийся в ведении полученной массы побегов на микрочеренки, которые используются в качестве вторичных эксплантов для повторения цикла размножения, введение в питательную среду веществ с цитокининовой активностью приводит к образованию пучков маленьких побегов, пазушные почки дают начало новым побегам, считается, что метод имеет минимальную степень риска для получения однородного потомства; в) получение каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза, теоретически этот метод наиболее перспективен с точки зрения коэффициента размножения, однако, в процессе дедифференциации появляется риск получить вегетативное потомство с вмененными формами, поэтому рекомендуется избегать длительной каллусной культуры и вести обязательный цитологический контроль растений-регенерантов.
Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК. Генетическая инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства. Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний. Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:
При получении клеточных линий с полезными признаками встает проблема сохранения этих признаков. Растения могут хранить генетическую информацию в семенах, однако этот источник не вполне надежен, так как со временем из-за мутаций всхожесть семян падает. Кроме того, некоторые растения размножаются только вегетативно. Этим обусловлена необходимость сохранения части материала in vitro. С другой стороны, в некоторых случаях удается получить новые клеточные линии, синтезирующие большее количество вторичных метаболитов, то есть более продуктивные, которые тоже нуждаются в сохранении. Для исследования физиологических и биохимических процессов, протекающих в тканях, также требуются стандартные исходные культуры, чем вызвана необходимость сохранять материал в течение определенного промежутка времени, когда идут серийные эксперименты. Все это делает проблему сохранения генофонда весьма актуальной. Можно, конечно, пассировать и перевивать клеточные культуры. Однако при этом возникает опасность сомаклональной изменчивости, накопления мутаций, контаминаций (заражения чужеродным генетическим материалом). Это также требует определенных финансовых и трудовых затрат (необходимость частых пересадок, расходы, связанные со средой и т.д.). Существует разные подходы к сохранению культур: криосохранение, замедление роста, распылительная или лиофильная сушка (для клеток микроорганизмов). Криосохранение - замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре -196oC. Успех низкотемпературной консервации зависит от ряда факторов: - вид и тип клеток, - их концентрация в суспензии, - состав среды для консервирования, - вид и концентрация криопротектора, - режим охлаждения и отогрева, - способ реабилитации клеток после отогрева. Существенную роль в успешном замораживании клеток играет их морфофизиологическое состояние: клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему действию низкотемпературной консервации, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста. Клетки для замораживания отбирают в середине экспоненциальной фазы ростовой кривой. Немаловажное значение имеет и плотность замораживаемой суспензии. Оптимальные результаты по восстановлению клеток были получены при замораживании клеточной суспензии плотностью 1*105 - 5*106 клеток в 1 мл. Для растительных клеток часто требуется предварительное культивирование в особых условиях. В среду добавляют различные вещества, например:
Процесс замораживания растительных клеток от животных отличает, в основном, наличие этапа предварительного культивирования. Криопротекторы - вещества, позволяющие снизить повреждающее действие физико-химических факторов при криоконсервировании. К ним относятся сахароза, декстран, этиленгликоль, поливинилпирролидон, диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин. Для определения токсичности криопротектора клетки выдерживают при комнатной температуре в различных его концентрациях в течение 30 - 50 минут, после чего определяют их жизнеспособность. Дополнительно оценивают его протективные свойства путем пробного замораживания и оттаивания культур. Наиболее часто в качестве криопротекторов используют глицерин и ДМСО. Перед добавлением криопротектора суспензию клеток концентрируют путем центрифугирования, надосадочную жидкость сливают. Криопротекторы вносят в культуру за час до замораживания, что приводит к изменению проницаемости мембраны, изменению точки замерзания и оттаивания. Программы охлаждения могут быть различными, но для всех них характерна медленная скорость охлаждения. При замораживании происходит образование льда внутри и снаружи клеток. Характер этих изменений зависит от изучаемого образца и обработки криопротекторами, но главным образом, от скорости охлаждения. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки. В этом случае клетки повреждаются. Обычно охлаждение проводят в два этапа: - Первый этап - от +20 до -28oC со скоростью 1 градус в минуту (для растительных клеток скорость замораживания 0,5 градуса в минуту до -35оС), выдерживают при этой температуре 15 минут; - Второй этап: погружение в жидкий азот (мгновенное охлаждение до - 196oC). Замораживание производят в специальных аппаратах. При их отсутствии - на спиртовой бане (0,5 - 1 литр спирта наливают в термос с металлической колбой, погружают в него ампулы на 15 минут и добавляют при помешивании жидкий азот или сухой лед; доводят температуру до -32oC (температура должна быть не выше -28 и не ниже -32оС). Далее переносят ампулы в жидкий азот. При размораживании ампулы пинцетом переносят в водяную баню с температурой +37+40оС, ампула объемом в 1 мл размораживается в течение 0,5 - 1 минуты. После размораживания растительные клетки отмывают 3 - 10% раствором сахарозы. Далее клетки проверяют на жизнеспособность с помощью витальных красителей, окрашивающих мертвые клетки. Окончательным критерием служит четкое возобновление роста на стандартных питательных средах, используемых для данной культуры. Перевиваемые культуры животных клеток после размораживания имеют повышенную чувствительность к вирусам, которая проявляется в течение первых двух пассажей. Далее чувствительность возвращается к исходной. 2. Организация биотехнологической лаборатории
и правила работы с ним Для организации биотехнологической лаборатории необходимы просторные изолированные помещения, а также современное оборудование и высококачественные реактивы. Для удобства проведения дезинфекции полы стены и потолок в помещениях должны иметь водостойкое и ультрофиолетоустойчивое покрытие. Оборудование моечного помещения: мойки с горячей и холодной водой; дистиллированная вода; дистилляторы и бидистилляторы; сушильные шкафы с режимом работы для сушки посуды – до 100-130оС, для инструментов – до 170оС; шкафы для хранения чистой посуды и инструментов, емкости для хранения моющих средств, вытяжные шкафы с эксикаторами для хромпика (H2SO4 98 % + K2CrO7). Оборудование помещения для приготовления питательных сред: лабораторные столы; холодильники для хранения маточных растворов солей, гормонов и витаминов; аналитические и торсионные весы; иономер; магнитные мешалки; плитки, газовые горелки; набор посуды (колбы, стаканы, мерные цилиндры, мензурки, пробирки и др.), необходимый набор химических реактивов надлежащей степени чистоты (ХЧ, Ч, ЧДА). Оборудование помещения для стерилизации: автоклавы с режимом работы – давление 1-2 атмосферы и температура 120оС; стеллажи для штативов с питательными средами; шкафы для хранения стерильных материалов. Данное помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и иметь канализационный слив для отвода конденсата из автоклава. Оборудование помещения для инокуляции растительных эксплантов на питательные среды: ламинар-боксы, лабораторные столы, стеллажи, бактерицидные лампы, шкафы для материалов и оборудования. Оборудование культуральных помещений: световое отделение – источники освещения со спектром близким к спектру дневного света (от 3 до 10 kLx), кондиционер для регуляции температуры (25±2оС) и влажности воздуха (70 %), стеллажи для штативов с культивируемым материалом; темновое отделение – с тем же оборудованием, исключая источники освещения. Для культивирования эксплантов на питательной среде желательно использовать термостаты или хладотермостаты, способные с высокой точностью поддерживать задаваемые режимы температуры и влажности воздуха. Необходимый набор посуды, инструментов и материалов в биотехнологической лаборатории: мерные колбы, колбы Эрленмейера, химические стаканы, мерные цилиндры, чашки Петри, пробирки, бутылки, пипетки, стеклянные палочки, стеклянные и мембранные фильтры, ланцеты (в том числе глазные, хирургические, анатомические), ножницы, пинцеты, ножи, бритвенные лезвия, препарировальные иглы, шпатели, бумага (оберточная, пергаментная, фильтровальная), фольга алюминиевая, вата, марля, шпагат.
При работе в стерильном помещении лаборатории все сотрудники бактериологической лаборатории обязаны соблюдать следующие правила работы, которые обеспечивают стерильность в работе и предупреждают возможность возникновения внутрилабораторных заражений: 1. Все лица, находящиеся в лаборатории, должны быть в халатах, сменной обуви (либо бахилах), белой шапочке или косынке. 2. В помещении запрещается прием пищи и курение, хранение продуктов питания. 3. Нельзя вносить в лабораторию посторонние вещи. 4. Запрещается выходить за пределы лаборатории в халатах или надевать верхнее платье на халат. 5. Каждый работник должен пользоваться только своим рабочим местом. 6. Все операции должны производиться с соблюдением правил стерильности: все стерильные работы проводят вблизи пламени горелки, переливание зараженных жидкостей производят над лотком с дезинфицирующим раствором и т. п. 7. Нужно строго следить за чистотой рук: по окончании работы с заразным материалом их дезинфицируют. Рабочее место в конце дня приводят в порядок и тщательно дезинфицируют. 8. Весь инвентарь, находившийся в контакте с заразным материалом, подлежит стерилизации или уничтожению. Биотехнологическую лабораторию необходимо содержать в чистоте. Следует регулярно проводить гигиеническую уборку помещений лаборатории. Обеспечить полную стерильность лаборатории очень трудно и это не всегда необходимо, но значительно снизить количество микроорганизмов в воздухе и на различных поверхностях в лабораторных помещениях возможно. Это достигается путём применения на практике методов дезинфекции, то есть уничтожения возбудителей инфекционных болезней на объектах внешней среды. Для культивирования стерильных проростков необходимо использовать ламинар-боксы, обеспечивающие посадку эксплантов на питательную среду без заражения микроорганизмами. Все поверхности ламинара обрабатываются 96 % спиртом, простерилизованные инструменты, материалы, растительный материал помещают на стол ламинара и включают УФ-излучение. Через 20 минут выключают УФ и включают биофильтры. Для работы в ламинар-боксе надевают стерильный халат и шапочку, руки обрабатываю 96 % спиртом. Пинцеты, скальпели и препарировальные иглы помещают в стакан с 96 % спиртом. Перед каждой манипуляцией инструменты обжигают на пламени спиртовки. В случае нарушения стерильности на средах хорошо развиваются микроорганизмы (грибы, бактерии), нарушающие состав среды и подавляющие рост растительных эксплантов. Посуду, халаты, вату, бумагу, дистиллированную воду, питательные среды стерилизуют в автоклавах под давлением пара 1-2 атмосферы и температурой 120оС в течении 20-60 мин, в зависимости от объёма стерилизуемого материала. Колбы, штативы со средой, вату, бумагу, халаты перед автоклавированием заворачивают в целлофановую бумагу, либо помещают в биксы. Металлические инструменты автоклавировать нельзя, так как под действием пара образуется ржавчина. Поэтому их стерилизуют сухим жаром в термостатах с температурой 170-250оС в течении 1-2 часов. Лабораторная работа № 1 |
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | ... | | С. П. Фирсовой – доктором медицинских наук, профессором кафедры общественного здоровья и организации здравоохранения игму |
| Учебно-методическое пособие предназначено для студентов очной и заочной формы обучения факультета ветеринарной медицины по специальности... | | Учебно-методическое пособие предназначено для студентов лечебного, педиатрического, медико-профилактического, стоматологического... |
 | Учебно-методическое пособие составлено на кафедре неврологии Гродненского государственного медицинского института | | Данное учебно-методическое пособие составлено в помощь учителям биологии, учащимся старших классов общеобразовательных школ, абитуриентам... |
| Учебно-методическое пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Педиатрия» | | Учебно-методическое пособие по офтальмологии для студентов педиатрического факультета. Ставрополь. Изд: сгма, 2009 г |
| Методическое пособие предназначено для врачей-стоматологов государственных и частных лечебных учреждений. Пособие может быть использовано... | | К 61 Духовно-нравственная культура: учебно-методическое пособие для образовательных учреждений. – Омск : боудпо «ирооо», 2009. –... |