Учебно-методическое пособие Мероприятие 2
Скачать 0.64 Mb.
|
| Тема: «Приготовление и стерилизация питательной среды Мурасиге-Скуга» Материалы и оборудование. Химические стаканы, колбы, мерные цилиндры от 5 мл до 2 л, пробирки, пипетки от 0,01 мл до 10 мл или дозаторы, весы аналитические до 500 г, весы торсионные до 100 мг, пинцеты, ножницы, шпатели, электроплитки, магнитные мешалки, химические реактивы или готовые маточные растворы макро- и микросолей, витаминов, фитогормонов. Ход работы.
4. Типы эксплантов: Способы получения и методы стерилизации 4.1. Выделение апикальных меристем В культуре тканей можно размножать растения и получать оздоровленный (безвирусный) посадочный материал. Для оздоровления растений используют культуру апексов или культуру апикальных меристем, так как в стеблевой апекс вирусы проникают медленнее, чем в другие части растений. При культивировании апексов размножение вирусов подавляется реакцией растительного организма на травму, вызванную отсечением верхушки. В in vitro используются апексы верхушечных и боковых почек (точек роста), кончиков корней (особенно проростков). Апикальная меристема — группа меристематических (образовательных) клеток, организованных в ростовой центр, занимающая терминальное положение в побеге или корне и обеспечивающая образование всех органов и первичных тканей. Верхняя часть апикальной меристемы представлена инициалями (единственной клеткой — у хвощей и многих папоротников и многоклеточной структурой — у семенных растений). Ближайшие производные инициальных клеток часто выделяют в зону протомеристемы. Вслед за ней лежат ткани, уже частично дифференцированные, но всё ещё находящиеся в меристематическом состоянии, которые относят к частично детерминированной первичной меристеме. В зависимости от производимых ею систем тканей детерминированная меристема включает следующие клеточные комплексы: тунику, образющую в дальнейшем первичную покровную ткань (эпидермис) и часть первичной коры, и корпус, клетки которого постепенно формируют комплекс проводящих тканей (центральный цилиндр); в корне — дерматоген, дифференцирующийся в первичную покровную ткань (ризодермис); периблему — будущую первичную кору; плерому — центральный цилиндр. Таким образом, будущий ход развития меристематических тканей частично детерминирован уже самим размещением их в апексе побега и корня. Обычно на питательные среды высаживают небольшую часть меристемы до 0,5 мм. В целом закономерность такова: чем меньше величина меристемы, тем больше вероятность получения безвирусных растений. Ее выделение осуществляется в ламинар-боксе с использованием препаравальных инструментов под увеличением бинокулярного микроскопа.  Рис. Апикальная меристема в верхушечной почке побега элодеи (Elodea canadensis): А - продольный разрез; Б - конус нарастания (внешний вид и разрез); В - клетка первичной меристемы; Г - клетка из сформировавшегося листа (1 - конус нарастания, 2 - первичный бугорок, 3 - вторичный бугорок - бугорок пазушной почки, 4 – примордии - зачаточные листьев).  Фото Апикальная меристема лилейника  Рис. Апикальная меристема в кончике корня: 1 - калиптроген, 2 - дерматоген, 3 - периблема, 4 - плерома, 5 - ряд клеток, из которых образуется стела, 6 - сброшенные чехликом клетки, 7 - колумелла. Культивирование растений из апикальных меристем позволяет получать безвирусный оздоровленный посадочный материал практически всех сельскохозяйственных культур. Наиболее полно разработана технология получения безвирусного картофеля. Так система первичного семеноводства и оздоровления посадочного материала картофеля включает следующие этапы: подготовка клубней для вычленения апикальных меристем, вычленение апикальных меристем, регенерация растений из меристем, адаптация растений-регенерантов в защищенном грунте, получение первой продукции безвирусного материала в открытом грунте, выращивание безвирусного посадочного материала в первичных звеньях семеноводства, сохранение коллекции сортов. В культуре тканей используются апексы верхушечных и боковых почек. Чтобы исключить влияние метаболитов клубня на проростки и повысить регенерационную способность исходного материала из средней части клубня вырезают глазки с частью паренхимы (1,5 х 1,5 см). Глазки проращивают на песке, предварительно обработанном сухим жаром. Этиолированные проростки выращивают в темноте при температуре 25±2оС, влажности воздуха 70-80 %. Песок дважды в день увлажняют, через 7-10 дней проводят подкормку раствором Кнопа. Апикальные меристемы проростков изолируют на 12-13 пластохроне (промежуток времени между инициациями двух листовых бугорков). Изолированные меристемы культивируют в асептических условиях на питательных средах с богатым содержанием макро- и микросолей, с повышенной концентрацией цитокининов (6-БАП 2 мг/л). В культуральной комнате с кондиционированным воздухом поддерживают температуру 25±2оС, влажность воздуха 70 %, освещенность 5 кLx и фотопериод 16 часов. В среднем от посадки меристемы на среду до формирования проростков с 5-6 листочками проходит 30-45 дней, в некоторых случаях от 2 до 8 месяцев. Среды по мере истощения обновляют, и проростки периодически пересаживают на новые среды в стерильных условиях. 4.2. Выделение клеток, их групп и тканей. Регенерацию растений из культуры тканей можно получить, используя один из трех методов: культуру зародышей, органогенез, соматический эмбриогенез. Соматический или неполовой эмбриогенез представляет собой процесс формирования зародышеподобных структур из соматических клеток. Соматический зародыш - это независимая двухполюсная структура, физически не прикрепленная к ткани, из которой она происходит. Такие зародыши в дальнейшем могут развиваться и образовывать регенеранты через стадии, соответствующе тем, что встречаются при развитии зиготы. Подобное явление можно встретить у многих видов растений в условиях in vitro при работе с культурами различных типов клеток, тканей и органов, тогда как в природе такие процессы происходят внутри семяпочки. При соматическом эмбриогенезе переноса каллуса на среду без регуляторов роста обычно бывает достаточно для стимуляции более поздних стадий развития зародыша и его последующего прорастания. Образование соматических зародышей из культур клеток, тканей и органов может происходить прямым или непрямым путем. Прямой соматический эмбриогенез заключается в формировании вегетативного зародыша из одной или нескольких клеток ткани экспланта без стадии образования промежуточного каллуса. Такое явление наблюдается у цитрусовых, где ткани нуцеллуса дают начало нуцеллярным зародышам. Есть данные о прямом эмбриогенезе в некоторых культурах пыльников и протопластов. Однако по сравнению со случаями непрямого эмбриогенеза эти случаи редки. Непрямой эмбриогенез состоит из нескольких этапов: помещения экспланта в культуру, последующей стимуляции роста каллуса и формирования предзародышей (обычно на среде, содержащей высокие концентрации ауксинов), и переноса каллуса на питательную среду без регуляторов роста, для того чтобы индуцировать формирование биполярных зародышей из предзародышей. При подходящих условиях эти зародыши прорастают и образуют растения - регенеранты. Каллус по своей природе гетерогенен и может состоять из клеток многих типов, включая инициали предзародышей. Инициали предзародышей могут состоять из одной клетки или представлять собой многоклеточные образования. Когда каллус переносят на среду с низким содержанием ауксина, происходит процесс дальнейшего эмбриогенеза, при котором образуется большое число предзародышёй, а ранее сформировавшиеся инициали предзародышей развиваются в биполярные зародыши. Развитие зародышей происходит асинхронно. Формирование соматических зародышей может быть достигнуто путем использования соответствующей питательной среды, условий культивирования и отбора экспланта. Соматический эмбриогенез моркови представляет собой классический пример регенерации растений по типу непрямого соматического эмбриогенеза. У моркови практически любая часть растения (корень, черешок листа, лист, стебель или зиготический зародыш) продуцирует эмбриогенный каллус. Из свежеизолированных эксплантов моркови и из линий каллусных клеток путем манипуляций со средой культивирования можно индуцировать образование соматических эмбриоидов. При развитии этих соматических эмбриоидов наблюдаются типичные стадии развития (глобула и торпедо). совпадающие со стадиями развития оплодотворенной яйцеклетки в зародышевом мешке развивающегося семени моркови. Это явление может служить одним из доказательств тотипотентности клеток высших растений. Морфогенетическая способность клеток в культуре клеток при продолжительном культивировании обычно изменяется. В клетках моркови, например, она может полностью пропадать через 30-40 недель после изолирования экспланта, но изменением состава сред культивирования ее можно возвратить. Это означает, что генетическая информация, необходимая для эмбриогенеза, всегда присутствует в клетках и, что существуют определенные эпигенетические факторы, которые необходимы для регуляции соматического эмбриогенеза в культуре клеток моркови. В данной работе изучают эффект двух компонентов среды культивирования на соматический эмбриогенез в закончивших рост каллусных линиях моркови. 4.3. Получение микрочеренков Использование микрочеренков при клональном размножении растений in vitro имеет наиболее широкое распространение. В качестве черенков чаще всего используются просыпающиеся почки или верхушки молодых побегов. В некоторых случаях используются листовые черенки – растения способные продуцировать особи из фрагментов листьев или их черешков (сенполии, стрептокарпусы, бегонии королевские, сансивьеры и др.)  Фото Типы стеблевых черенков для введения в in vitro  Фото Типы листовых черенков для введения в in vitro 4.3. Получение микрочеренков. Использование микрочеренков при клональном размножении растений in vitro имеет наиболее широкое распространение. В качестве черенков чаще всего используются просыпающиеся почки или верхушки молодых побегов. У корневищных многолетников (хосты, ветреницы, астильбы, акониты и др.) используют подземные почки корневища. У луковичных листовые чешуи (лилии) или центральные почки (нарциссы, тюльпаны) луковиц. В некоторых случаях используются листовые черенки – растения способные продуцировать особи из фрагментов листьев или их черешков (сенполии, стрептокарпусы, бегонии королевские, сансивьеры и др.). При этом главным является отбор черенков на начальных этапах сезонного роста. В этот период их инфицирование значительно меньше и повышенный гормональный фон способствует более эффективному введению. При введении таких черенков in vitro используется этапная стерилизация исходного материала с использованием спирта, перекиси водорода и хлорсодержащих препаратов. При удачном введении в последствии дальнейшее их клонирование осуществляется с использованием микрочеренков, которые представляют собой нарезанные фрагменты побегов с 1-3 узлами, или отделенные пучки мелких побегов, обильно нарастающих в базальной части. Этот же способ размножения может быть использован и с растениями стерильными после развития растений из калюсных культур. Микрочеренки отделяются от материнского клона и рассаживаются в новые колбы с агаризованной средой. При достижении ими «товарных» размеров их высаживают на среду с повышенным фоном ауксинов (0,5-3,0 мг/л) для окончательного укоренения. После чего растения готовы к высадке из колб на почвенный субстрат и адаптации к нестерильным условиям. Этот способ значительно сокращает сроки процесса размножения (минуя стадии калюсообразования), однако при этом не происходит очищение материала от вирусов. Этот способ размножения основан на формирование адвентивных почек и побегов. Способность к индукции адвентивных почек в обычных условиях встречается у некоторых видов растений (например, в роде бегония). Такая индукция в значительной степени определяется содержанием гормонов в среде или регулярным механическим повреждением верхушечной почки механически (срезкой верхушек). Результат - снятие апикального доминирования и закладка адвентивных почек. Этот метод уже стал промышленным при производстве посадочного материала некоторых культур. Эта модель наиболее детально была отработана на картофеле. При работе с картофелем чаще всего пользуются черенкованием. Для этого выросший в пробирке из меристемы побег расчленяют с соблюдением стерильности на фрагменты размером 0,5-1,0 см, каждый из которых должен иметь листочек и пазушную почку. Эти черенки сразу же помещают на питательную среду того же состава для доращивания и укоренения. При этом среда может быть как плотной (т.е. с агаром), так и жидкой. Как только высаженные черепки сформируют из пазушной почки новый побег, последний вновь черенкуют. Таким образом, из ограниченного числа «меристемных» растений за несколько месяцев можно получить большое количество безвирусного посадочного материала (за полгода- 30000). При этом за каждый цикл черенкования оно возрастает и 4-5 раз. По мнению многих исследователей, способы размножения на основе снятия апикального доминирования имеют минимальную степень риска в отношении получения неоднородного потомства. Частота появления мутантных форм (в расчете на число новообразований) здесь не превышает частоту появления таковых при размножении растения обычными методами. Данный способ получает все большее распространение в практике. Он универсален и отличается относительно высокой воспроизводимостью полученных результатов. 4.4. Стерилизация эксплантов и введение в «in vitro» С целью получения эксплантов для каллусной и опухолевой культур, микроклонального размножения, изучения гормональной регуляции используют стерильные проростки. Семена для проращивания высевают либо на воду, либо на питательную среду. Растительные объекты перед стерилизацией тщательно отмывают проточной водой, иногда с моющими средствами, очищают от излишних тканей. С корнеплодов и корней снимают кожуру, с побегов – кору, с почек – кроющие чешуи. Растительные экспланты стерилизуют растворами веществ, содержащими активный хлор (хлорамином, гипохлоритом Nа), бром (бромной водой), tween-20, перекисью водорода, спиртом, нитратом серебра, диацидом, антибиотиками. Следует подбирать такие концентрации стерилизующих агентов, которые не повреждали бы сами семена, не угнетали их всхожесть и обеспечивали максимальную стерильность. Этиловый спирт часто применяют для предварительной стерилизации, протирая им поверхность материала или погружая материал на несколько секунд в абсолютный спирт. Иногда такой стерилизации достаточно, ее используют при работе с плодами, семенами, побегами, завязями. Гипохлорит кальция (хлорная известь) используется в виде 5-7 % раствора для обработки почек, завязей, цветков, семян, побегов в течение 5-8 минут. Гипохлорит натрия используется в виде 0,5-5 % раствора для обработки любых эксплантов в течение 1-20 минут. Это вещество является клеточным ядом, поэтому время стерилизации и концентрацию подбирают экспериментально. Например: для изолированных зародышей используют 2-3 % раствор в течение 10-15 минут, а для сухих семян 3-5 % раствор в течение 1 часа. Остатки гипохлорита натрия сначала удаляют 0,01 н HCl, а затем 8 раз промывают автоклавированной дистиллированной водой. Хлорамин применяют в концентрации 1-6 %. Пыльники и молодые зародыши обрабатывают в течение 1-3 минут, сухие семена – 30-60 минут, затем промывают стерильной дистиллированной водой 2-3 раза. Сулема – токсичное вещество и требует особой тщательности, как при хранении, так и при подборе концентрации для отдельных объектов. Для стерилизации зародышей используют 0,1 % раствор в течение 1-3 минут, для корне- и клубнеплодов – до 10-20 минут. Растворы, содержащие активный хлор используются 1 раз и готовят их непосредственно перед работой. Диацид используется в 0,2 % растворе для стерилизации корнеплодов, семян, кусочков, тканей, верхушечных меристем, изолированных зародышей, пыльников. Диацид готовят, растворяя отдельно 330 мг этанолмеркурхлорида и 660 мг цетилпиридиния хлорида в горячей воде (330 мл), затем их смешивают и доводят объем жидкости до 1 л, добавляют несколько капель детергента твин-80; хранят в плотно закрытой колбе в темноте. Антибиотики применяют для стерилизации растительного материала, инфицированного бактериями (ткани корончатогалловых опухолей). Наиболее часто применяют стрептомицин и тетрамицин 10-80 мг/л, ампициллин 200-400 мг/л, левомицитин, каномицин и другие. В качестве стерилизующего агента применяют также перекись водорода, которая менее всего повреждает экспланты и после которой не требуется отмывка в стерильной воде, так как она быстро разлагается. Стерилизацию эксплантов необходимо проводить в стерильных (асептических) условиях: в ламинар-боксе. Колбы с эксплантами после помещаются в абсолютную темноту при комнатной температуре на неделю для выявления степени стерильности. Те колбы, в которых началось заражение, следует сразу удалять. Лабораторная работа № 3 |
Похожие:
 | ... | | С. П. Фирсовой – доктором медицинских наук, профессором кафедры общественного здоровья и организации здравоохранения игму |
| Учебно-методическое пособие предназначено для студентов очной и заочной формы обучения факультета ветеринарной медицины по специальности... | | Учебно-методическое пособие предназначено для студентов лечебного, педиатрического, медико-профилактического, стоматологического... |
 | Учебно-методическое пособие составлено на кафедре неврологии Гродненского государственного медицинского института | | Данное учебно-методическое пособие составлено в помощь учителям биологии, учащимся старших классов общеобразовательных школ, абитуриентам... |
| Учебно-методическое пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Педиатрия» | | Учебно-методическое пособие по офтальмологии для студентов педиатрического факультета. Ставрополь. Изд: сгма, 2009 г |
| Методическое пособие предназначено для врачей-стоматологов государственных и частных лечебных учреждений. Пособие может быть использовано... | | К 61 Духовно-нравственная культура: учебно-методическое пособие для образовательных учреждений. – Омск : боудпо «ирооо», 2009. –... |