Распределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка






Скачать 325.77 Kb.
НазваниеРаспределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка
страница1/2
Дата публикации14.06.2015
Размер325.77 Kb.
ТипАвтореферат
d.120-bal.ru > Документы > Автореферат
  1   2



На правах рукописи

 

Елистратова Елена Владимировна

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АБЕРРАНТНО МЕТИЛИРОВАННЫХ ФОРМ ГЕНОВ ОПУХОЛЕВОЙ СУПРЕССИИ В ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ДНК КРОВИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА
 

14.00.14 - онкология

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук
 

Томск-2008

Р


абота выполнена в ГУ Научно-исследовательский институт онкологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской Академии Медицинских наук и Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской Академии наук.

Научные руководители:

Доктор медицинских наук,

профессор Тузиков Сергей Александрович

Кандидат биологических наук Рыкова Елена Юрьевна
Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук,

профессор Чердынцева Надежда Викторовна

Доктор медицинских наук,

профессор Тихонов Виктор Иванович

Ведущая организация: ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН

Защита диссертации состоится «___» __________ 2008 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.032.01 при ГУ НИИ онкологии ТЦН СО РАМН по адресу: 634009, г. Томск, пер. Кооперативный, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН

Автореферат разослан «___» ___________________ 2008 г

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук Фролова И.Г.
Актуальность проблемы. Рак желудка (РЖ) является четвертой по частоте формой злокачественных новообразований и занимает второе место в структуре общей летальности от злокачественных новообразований (Parkin M. et al., 2005). Статистические данные объясняются поздним выявлением РЖ, когда основной метод радикального лечения этого заболевания, а именно хирургический, является мало эффективным (Симонов Н.Н. с соавт., 2001). Совершенно очевидно, что решения проблемы ранней диагностики рака желудка необходимы надежные и простые методы детекции опухолевого процесса, которые позволяли бы выявлять опухоль на доклинических стадиях. Известно, что трансформация клеток в раковые и прогрессия онкологического процесса связаны с накоплением генетических и эпигенетических изменений в геноме (Lengauer C. et al., 1998, Egger G. et al., 2004). На сегодняшний день известно, что аберрантное метилирование ДНК является одним из наиболее распространенных и ранних событий, приводящих к опухолевой трансформации клетки при новообразованиях различной локализации, в том числе и при раке желудка (Esteller M., 2005). С наибольшей частотой в опухолевой ткани при раке желудка распространено аберрантное метилирование трех генов опухолевой супрессии: p15, hMLH1, MGMT (Sato F. et al., 2006, Leung W.K. et al., 2001, Carvalho B. et al., 2003), что открывает большие возможности для разработки методов ранней диагностики рака желудка. Однако, проведение исследования ткани опухоли возможно лишь при визуально детектируемом изменении слизистой оболочки желудка, и, таким образом, этот метод не может быть использован ни для выявления ранних стадий развития опухолей, ни для мониторинга рецидивов. Наиболее перспективным представляется малоинвазивное выявление ДНК-онкомаркеров в крови. Разработка таких методов анализа стала возможной сравнительно недавно, когда было обнаружено, что в составе свободно циркулирующих ДНК (цирДНК) плазмы крови больных выявляются изменения (генетические и эпигенетические), идентичные изменениям ДНК в клетках опухоли (Anker P., 2003). Такие онкоспецифические ДНК присутствуют в крови в низкой концентрации, что приводит к более низкой частоте выявления эпигенетических маркеров в плазме крови больных раком желудка по сравнению с частотой их выявления в образцах опухолевой ткани (Lee T-L. et al., 2002).

В настоящее время получены убедительные данные, демонстрирующие, что внеклеточные ДНК не только свободно циркулируют в плазме крови, но также могут быть связаны с поверхностью форменных элементов крови (Laktionov P.P. et al., 2004). Особый интерес вызвал тот факт, что в составе цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, как и в ДНК плазмы, обнаруживаются онкоспецифические последовательности ДНК (Rykova E.Y. et al., 2004). Эти данные позволяют надеяться, что проблема более низкой частоты детекции гиперметилированных генов опухолевой супрессии в крови по сравнению с исследованием опухолевой ткани при раке желудка может быть успешна преодолена. Все сказанное определяет актуальность исследования распределения аберрантного метилирования генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка.

Цель исследования. Изучение особенностей циркуляции внеклеточных ДНК и распределения онкоспецифических последовательностей в крови больных раком желудка с разными клинико-морфологическими параметрами течения заболевания

Задачи исследования:

  1. Определить концентрацию цирДНК и изучить распределение между фракциями плазмы и связанных с клеточной поверхностью форменных элементов крови у больных раком желудка на разных стадиях заболевания.

  2. Проанализировать частоту выявления аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии p15, MGMT, hMLH1 в цирДНК плазмы и фракции связанной с поверхностью клеток крови у больных раком желудка на разных стадиях заболевания.

  3. Провести сравнительное исследование чувствительности и специфичности анализов эпигенетических маркеров (p15, MGMT, hMLH1) в цирДНК и стандартных онкоспецифических белков (РЭА, СА 19.9, СА 72.4) при раке желудка.

Научная новизна.

Впервые показано, что по мере распространенности рака желудка происходит достоверное увеличение концентрации цирДНК плазмы, тогда как концентрация цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, достоверно не изменяется.

Получены новые данные о возможности выявления у больных раком желудка онкоспецифических последовательностей в цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, что значительно повышает частоту выявления эпигенетических маркеров по сравнению с использованием только цирДНК плазмы. Показано, что аберрантное метилирование является характерным изменением для всех исследуемых стадий рака желудка.

Между детекцией эпигенетических маркеров и повышенным уровнем опухолеспецифических белков (РЭА, СА 19.9 и СА 72.4) отсутствует корреляционная зависимость, таким образом, данные изменения имеют независимое значение при развитии рака желудка и отражают разные стороны патогенеза.

Теоретическая и практическая значимость.

Достоверное увеличение концентрации цирДНК плазмы у больных раком желудка по мере распространения опухолевого процесса свидетельствуют о том, что анализ концентрации цирДНК плазмы является эффективным показателем при дифференцировке больных раком желудка и могут быть использованы для оценки стадии заболевания.

Суммарная цирДНК, а именно ДНК плазмы и связанная с клеточной поверхностью, повышает чувствительность детекции метилированных аллелей генов опухолевой супрессии (MGMT, p15, hMLH1) по сравнению с использованием только цирДНК плазмы у больных раком желудка.

Положения, выносимые на защиту.

  1. У больных раком желудка по мере распространенности заболевания статистически значимо возрастает уровень цирДНК плазмы. В то время как уровень цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, не изменяется.

  2. При раке желудка использование суммарных цирДНК крови позволяет детектировать опухолевые изменения (метилирование аллелей генов р15 и hMLH1) с чувствительностью 63% и специфичностью 63%. Метилированные формы генов выявляются в суммарных цирДНК при раке желудка с одинаковой частотой на разных стадиях заболевания.

  3. При раке желудка частота выявления ДНК-маркеров (метилированных аллелей генов MGMT, p15 и hMLH1) существенно выше по сравнению с выявлением повышенного уровня белковых маркеров РЭА, CA 19.9 и CA 72.4. Показано отсутствие достоверной корреляции между детекцией эпигенетических и белковых маркеров опухолевого процесса.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 17 тезисов. Результаты работы были представлены на конференциях «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Россия, 2004), «Biotechnology and oncology» и «Новые технологии в онкологической практике» (Россия, 2005), «Петровские чтения-2006» и «Актуальные вопросы экспериментальный и клинической онкологии» (Россия, 2006), «Фундаментальные науки-медицине», XI Российский Онкологический конгресс и II Молодежный Медицинский Конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения» (Россия, 2007).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования и их обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Работы изложена на 93 страницах машинописного текста (12 шрифт, двойной интервал), содержит 11 рисунков и 19 таблиц. Библиография включает 127 литературных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Характеристика группы больных.

В исследование было включено 60 больных раком желудка (средний возраст 64±9 лет) T1-4N0-3M0-1, первично поступивших в хирургическое отделение Новосибирского областного онкологического диспансера с 2003-2008 год (табл. 1). Стадия онкологического процесса определялась в соответствии с Международной классификации опухолей по системе TNM (ВОЗ, 1990). Формирование группы осуществлялось после постановки диагноза на основании клинического, морфологического, эндоскопического, рентгенологического обследования и по результатам оперативного вмешательства.

В зависимости от распространенности онкологического процесса и гистологического типа из группы больных раком желудка были сформированы две подгруппы. В подгруппу больных с неблагоприятным прогнозом вошли пациенты IIIб-IV стадии заболевания и с морфологически подтвержденным перстневидноклеточным типом рака. Подгруппу больных с благоприятным прогнозом составили пациенты I-IIIa стадии онкологического процесса и с морфологически подтвержденными аденокарциномой разной степени дифференцировки и недифференцированным типами рака.

Контрольную группу составили 30 клинических здоровых людей – доноров отделения переливания крови Центральной Клинической Больницы Советского района г. Новосибирска (средний возраст группы 48±2 г.).
Таблица 1

Характеристика группы больных РЖ

Клинико-патологические

характеристики

Частота встречаемости

(количество человек n=60)

Пол

Мужской

Женский


36 (60%)

24 (40%)

Возраст

<60

>60


36 (60%)

24 (40%)

Стадия

Т1

T2

T3

T4

N0

Nx,1-2

Mo

M1





II

IIIа

IIIб

IV


1 (2%)

28 (46%)

18 (30%)

13 (22%)

25 (42%)

35 (58%)

46 (77%)

14 (23%)

1 (2%)

20 (33%)

8 (13%)

13 (22%)

1 (2%)

17 (28%)

Гистотип

Аденокарцинома разной степени дифференцировки

Недифференцированный рак

Перстневидноклеточный рак


36 (60%)
15 (25%)

9 (15%)



Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288). Получено разрешение этического комитета НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН.
Методы исследования.

Образцы венозной крови собирали в антикоагуляционный раствор. Для выделения цирДНК плазмы и связанных с клеточной поверхностью форменных элементов, обработку образцов крови производили методом двухстадийной элюции, а именно, последовательной обработкой форменных элементов крови фосфатным буфером, содержащим ЭДТА (ФБ-ЭБТА элюат) и раствором трипсина в условиях, не приводящих к лизису клеток (трипсиновый элюат) (Laktionov P.P. et al., 2004).

Выделение цирДНК из плазмы и из фракций, связанных с клеточной поверхностью для исследования концентрации проводили методом сорбции на модифицированном мелкодисперсном стекле (Лактионов П.П. с соавт. 2006). Концентрацию цирДНК в анализируемых образцах определяли при помощи флуоресцирующего интеркалирующего красителя Hoechst 33258. Для исследования статуса метилирования генов опухолевой супрессии циркулирующие ДНК крови выделяли из образцов плазмы и суммарного элюата с клеточной поверхности с использованием коммерческих наборов для выделения ДНК из плазмы крови (БиоСилика, Россия) согласно инструкциям от производителя. Метилирование промоторных областей генов MGMT, p15, hMLH1 в цирДНК исследовали методом ПЦР, специфичной к метилированию, после бисульфитной модификации ДНК (табл. 2). Продукты амплификции анализировали с помощью электрофореза в 6 % ПААГ в стандартных условиях.

Концентрацию белковых маркеров в плазме измеряли иммуноферментным анализом при помощи коммерческих наборов РЭА, CA 19.9 (Вектор-Бест, Россия), СА 72.4 (DRG, Германия) согласно инструкциям от производителя. Верхние границы нормы были установлены согласно рекомендациям фирм-производителей коммерческих наборов. Для РЭА верхняя граница нормы составила 5 нг/мл, для СА 19.9 – 37 ед/мл и для СА 72.4 - 6 ед/мл.

Для статистической обработки данных использовался пакет про­грамм STATISTICA® 6.0. Для статистической обработки данных были использованы следующие методы: критерий Стьюдента для независимых переменных - для оценки различий групп с нормальном распределением признака; критерий Манна-Уитни - для оценки различий между группами при отсутствии нормального распределения признака; односторонний критерий Фишера - для оценки различий групп по качественным признакам. Для оценки тесноты (силы) связи между переменными рассчитывался коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Различия считались достоверными при p<0,05.
Таблица 2

Последовательности праймеров, специфичные к метилированной (М) и неметилированной (U) формам генов MGMT, hMLH1, p15

Ген


M/U

Последовательности праймеров

Размер (пн)

Tm (°C)

Кол-во циклов

P15 P15 hMLH1 MGMT


M


M


M


U



прямой (5'-3')

TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC

обратный (5'-3')

GCACTCTTCCGAAAACGAAACG

прямой (5'-3')

TATATCGTTCGTAGTATTCGTGT

обратный (5'-3')

TCCGACCCGAATAAACCCAA

прямой (5'-3' )

GCGTTCGTATTTTGCGGTT

обратный (5'-3')

CGTACAATAACCGAACGACCGA

прямой (5'-3')

TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT

обратный (5'-3')

CCATACAATAACCAAACAACCAA



81


153

147


154



69


56

64


60



35


40

35


40



Собственные результаты и их обсуждение.
Концентрация циркулирующих ДНК в плазме клинически здоровых людей варьировала от 0 до 28 нг/мл и в среднем составляла 10 нг/мл. Концентрация цирДНК плазмы здоровых мужчин (среднее значение 13 нг/мл) достоверно не отличалась от концентрации цирДНК плазмы здоровых женщин (8 нг/мл) (p=0,1) (табл. 3). Полученные нами значения согласуются с данными других авторов, измерявших концентрацию цирДНК в крови здоровых доноров (Fleischhacker M. et al., 2007).

Нами было обнаружено, что в крови клинически здоровых людей основная часть (в среднем 97%) цирДНК связана с поверхностью форменных элементов крови. При этом даже если в плазме цирДНК не были выявлены, значительное количество нуклеиновых кислот было обнаружено на поверхности форменных элементов крови. Достоверной корреляции между концентрацией цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, и количеством форменных элементов клеток крови (лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов) по критерию Спирмена не обнаружено.

Общая концентрация связанных с поверхностью клеток нуклеиновых кислот была достоверно выше у мужчин (среднее значение 703 нг/мл), чем у женщин (429 нг/мл) при сравнении выборок по критерию Манна-Уитни (p=0,04) (табл. 3). Исходя из представленных данных о корреляции концентрации циркулирующих нуклеиновых кислот на поверхности клеток с полом у клинически здоровых людей, становится ясно, что при исследовании уровня циркулирующих ДНК, связанных с клеточной поверхностью, при различных патологиях необходимо учитывать пол пациента.

У больных раком желудка концентрация циркулирующих ДНК в плазме крови варьировала от 8 до 537 нг/мл, и в среднем составляла 99 нг/мл крови. У больных раком желудка мужчин среднее значение концентрации цирДНК плазмы составляло 116 нг/мл, для женщин данный показатель составил 77 нг/мл (табл. 3). Концентрация цирДНК в плазме больных мужчин достоверно не отличалась от концентрации ДНК в плазме больных женщин (критерий Манна-Уитни p>0,05).

Суммарная концентрация цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, выделенных из фракций ФБ-ЭДТА и трипсинового элюата, у больных раком желудка составила в среднем 547 нг/мл и достоверно не отличалась между мужчинами (442 нг/мл) и женщинами (685 нг/мл) (критерий Манна-Уитни p>0,05) (табл. 3).

При сравнении концентрации цирДНК плазмы нами было показано, что концентрация цирДНК у больных раком желудка (99 нг/мл) достоверно выше по сравнению с контрольной группой (10 нг/мл) (критерий Манна-Уитни p=0,001).

Таблица 3

Концентрации цирДНК в крови клинически здоровых людей и больных раком желудка*




Пол

ЦирДНК* плазмы

Связанные с поверхность клеток цирДНК*

Здоровые

Муж.

13 (М 14, Д 0-25)

703 (М 715, Д 190-1520)

Жен.

8 (М 6, Д 0-28)

429 (М 354, Д 121-871)

Больные РЖ

Муж.

116 (М 64, Д 8-527)

442 (М 457, Д 14-1464)

Жен.

77 (М 63, Д 10-1946)

685 (М 523, Д 74-1855)

* Концентрация цирДНК представлена в нг/мл крови

М- медиана нг/мл

Д- диапазон нг/мл
У больных раком желудка мужчин отмечалось снижение концентрации цирДНК, связанных с клеточной поверхностью, по сравнению со здоровыми мужчинами (табл. 3, критерий Манна-Уитни p=0,04). Было выявлено также снижение процента цирДНК, связанных с поверхностью клеток крови, от общего количества цирДНК (сумма цирДНК плазмы и связанных с поверхностью клеток крови) (в среднем 76% у больных и 98% у здоровых доноров, критерий Манна-Уитни p=0,01). У больных РЖ женщин показано отсутствие достоверных отличий концентрации цирДНК, связанных с клеточной поверхностью (табл. 3, критерий Манна-Уитни p>0,05), и их процента от суммарных цирДНК по сравнению с клинически здоровыми женщинами (87% и 97%, соответственно, критерий Манна-Уитни p>0,05).

Проведенные ранее исследования особенностей распределения в крови циркулирующих ДНК больных раком легкого и молочной железы выявили другие закономерности (Tamkovich S.N. et al., 2005, 2008). В данной работе показано, что выявленные нами изменения количества и распределения циркулирующих ДНК крови при раке желудка у мужчин и женщин являются характерными именно для этого заболевания.

С помощью построения характеристической кривой (ROC-анализ), мы выбрали пороговое значение концентрации цирДНК плазмы 25 нг/мл, при котором рак желудка с максимальной специфичностью и чувствительностью можно отличить от клинической нормы (рис. 1).

AUC=0,906

  1   2

Добавить документ в свой блог или на сайт

Похожие:

Распределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка iconБелайхун Кибрет аутоантитела к ДНК в сыворотке крови больных геморрагической...
Для большинства аутоиммунных заболеваний (аиз) характерно повышение содержания в сыворотке крови аат к нативной и (или) денатурированной...

Распределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка iconВлияние сывороточных антител к ДНК в норме и при аутоиммунных заболеваниях...
Онцентрации антител (АТ) к ДНК в крови, происхождение и биологическая роль которых не известна. Ат к ДНК могут взаимодействовать...

Распределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка iconОбеспечение периоперационного периода при радикальных операциях у больных раком желудка
Работа выполнена в фгбу «Научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук,...

Распределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка iconОсобенности генотипов Helicobacter pylori и полиморфных локусов генов...
Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ патогенеза Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра...

Распределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка iconКурение одна из вреднейших привычек
Стенокардией, в 12 раз Инфарктом миокарда, в 10 раз Язвой желудка. Курильщики составляют 96 100% всех больных Раком легких. Каждый...

Распределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка iconПрограммаэкзамен а для поступающих по специальности «Молекулярная генетика»
...

Распределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка iconКомбинированное лечение больных раком кардиального отдела желудка...
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения...

Распределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка iconИсследование больных с заболеваниями желудка
В диагностике заболеваний желудка большое значение имеют клинические методы обследования правильная оценка жалоб и анамнеза больного,...

Распределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка iconРепарация ДНК (Часть 1)
Днк и вызывают гибель клеток. Между тем ДНК постоянно подвергается химическим изменениям в результате воздействия как спонтанных,...

Распределение аберрантно метилированных форм генов опухолевой супрессии в циркулирующих ДНК крови больных раком желудка iconЛекция №1 Тема «Иммунотропные средства»
Е). Последующее взаимодействие антигенов (циркулирующих в крови или тканевых) с иммуноглобулинами часто приводит к повреждению тканей...

Вы можете разместить ссылку на наш сайт:


медицина


При копировании материала укажите ссылку © 2016
контакты
d.120-bal.ru
..На главную